Lactiplantibacillus plantarum LM1001 배양물이 반추위 내 발효특성과 온실가스 발생량에 미치는 영향

경남 진주시 소재 (주)락토메이슨에서 생산된 유산균 배양물(L. plantarum LM1001 culture, LPC)을 제공받아 실험에 이용하였다. 반추위 내 발효를 위해, 경상국립대학교 동물생명윤리위원회의 승인(GNU-191011-E0050)을 받아 in vitro 반추위 내 발효시험을 실시하였다[16]. 반추위액은 캐뉼라가 장착된 한우 암소 2두에게 조사료와 농후사료를 4:1 비율로 혼합한 사료를 체중의 약 2%를 급여한 후 익일 아침 사료 급여 직전(08:00)에 채취하였다. 채취한 위액은 4겹의 cheesecloth를 이용해 여과하였으며, 여과된 반추위액은 밀폐된 보온용기에 담고 CO₂ 충진을 통해 혐기적 상태를 유지하여 실험실로 이동하였다. 이동한 위액은 Van Soest medium과 1:2 비율로 혼합하여 rumen buffer를 제조하였다[16]. 반추위 내 발효특성 조사를 위한 기초사료는 원료사료의 차이에 의한 영향을 줄이기 위하여 분리정제된 전분(S4180, Sigma-Aldrich, MO, USA)과 셀룰로오스(C6413, Sigma-Aldrich)를 1:1로 혼합하여 사용하였다. 제조된 기초사료 0.3 g과 rumen buffer 30 mL을 125 mL serum bottle에 넣고(n = 4), rumen buffer를 기준으로 LPC를 0(대조구), 10(3 mL) 및 20%(6 mL) 첨가한 3처리구를 설정하여 39°C CO₂ incubator에서 12시간과 24시간 동안 각각 배양하였다. 배양이 종료된 후에는 Digital manometer(06-664-21 Fisher Scientific Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 total gas 발생량을 측정하였으며[17], 약 10 mL의 가스를 CH₄와 CO₂ 분석용으로 포집하였다. 또한 반추위 내용물은 4°C에서 15분간 2,568×g으로 원심분리(1248R, Labogene, Gimpo, Korea) 하여 상층과 하층을 분리하였다.

원심분리한 하층은 105°C 열풍건조기에서 48시간 건조하여 in vitro 건물 소화율(In vitro dry matter digestibility, IVDMD)을 측정한 후 550°C 회화로(Muffle furnace, Nabertherm, Liliental, Germany)에서 5시간 소화시켜 유기물 소화율(in vitro organic matter digestibility, IVOMD)을 분석하였다. 또한 원심분리한 상층은 pH, 휘발성지방산(volatile fatty acid, VFA) 및 암모니아태 질소(Ammonia-N) 분석에 이용하였다. pH는 pH meter(SevenEasy, Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)를 이용하였으며, VFA는 auto sampler(L-2200, Hitachi, Tokyo, Japan), UV detector(L-2400, Hitachi) 및 column(MetaCarb 87H, Varian, CA, USA)이 장착된 HPLC를 이용하였으며[16], ammonia-N은 비색법에 준하여 분석하였다[18]. 한편, 포집된 가스는 TCD detector와 column(Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agilent Technologies HP 5890, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 CH₄와 CO₂ 발생량을 분석하였다[19].

본 연구에서 얻어진 결과는 LPC 첨가수준에 의한 변화를 조사하기 위하여, general linear model(PROC GLM) statistical analysis system(SAS) program(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 polynomial contrasts(linear and quadratic effects)를 분석하였다. 또한 처리구 간의 유의성 검증은 Tukey’s test(p < 0.005)을 통해 실시하였다.

반추위 내 LPC 첨가수준을 달리하여 12시간 동안 발효시켰을 때, 영양소 소화율과 발효특성에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 1과 같았다. LPC 첨가수준이 건물(IVDMD)과 유기물(IVOMD) 소화율에는 영향을 미치지 않았다(p > 0.05). 하지만, LPC 첨가수준이 증가함에 따라 반추위 내 acetate 함량(linear, p = 0.027)은 감소하고, propionate 함량(linear, p = 0.015)은 증가하였으며, 이로 인해 A:P 비율(linear, p = 0.035)은 감소하였다. 특히, 반추위 내 acetate 함량(p < 0.05, 67.2% vs. 65.6% of M)은 대조구가 LPC 20% 첨가구에 비해 높았으며, propionate 함량(p < 0.05, 21.3% and 21.2% vs. 19.8% of M)은 LPC를 첨가한 모든 처리구가 대조구에 비해 높았다.

반추가축에게 유익한 균주 또는 그 배양물을 급여했을 때, 유기산, 펩타이드, 효소 등과 같은 유효성분으로 인해 반추위 내 소화율이 증가하는 것으로 보고되었다[11,12]. 특히, L. plantarum BX62를 적용하였을 때 건물 소화율이 증가하였으며[13], Ongole 품종의 교잡우에 L. plantarum을 급여하였을 때, 반추위 안정화로 유기물 소화율이 증가하였다고 보고되었다[20]. 하지만, 본 연구에서는 LPC 첨가수준이 건물과 유기물 소화율에 영향을 미치지 않았는데, 이것은 반추위 내용물과 미생물, 발효시간, 기초사료 등의 차이에 기인한 것으로 사료된다. 한편, 박테리오신 생성 L. plantarum을 알팔파 사일리지 제조 시 접종하였을 때, 반추위 내 propionate 함량이 증가한다고 보고되었다[21]. 또한 동일한 균주를 옥수수 사일리지 제조 시에 접종하였을 때, 반추위내 pH와 total VFA 농도에는 영향을 미치지 않았으나, propionate 함량은 증가하고 acetate 함량은 감소한다고 보고되었는데[22], 본 연구에서도 선행연구들과 유사한 연구결과가 확인되었다.

반추위 내 LPC 첨가수준을 달리하여 12시간 동안 발효시켰을 때, total gas, CH₄ 및 CO₂ 발생량에 미치는 영향을 조사한 결과는 Fig. 1과 같았다. 건물기준 total gas 발생량(mL/g DM)은 LPC 첨가수준이 증가할수록 증가하였으며(linear, p = 0.014), 건물 소화율(mL/g DMD)과 유기물 소화율(mL/g OMD) 기준에서는 감소하였다(quadratic, p < 0.05). 한편 LPC 첨가수준이 증가할수록 CH₄ 발생량은 건물(quadratic, p < 0.001), 건물 소화율(quadratic, p = 0.025) 및 유기물 소화율(quadratic, p = 0.009) 기준 모두에서 감소하였으며, CO₂ 발생량도 건물, 건물 소화율 및 유기물 소화율 기준 모두(quadratic, p < 0.05)에서 감소하였다. 특히, LPC 20% 첨가구에서 CH₄와 CO₂ 발생량이 가장 낮았다(p < 0.05).

Fig. 1. Effects of LPC supplement levels on total gas, CH₄, and CO₂ emissions incubated with rumen buffer for 12 h. ^a–cMeans among the treatment with different superscripts differ significantly (p < 0.05). DM, dry matter; DMD, dry matter digestibility; OMD, organic matter digestibility; LPC, Lactiplantibacillus plantarum LM1001 culture; L, linear effect; Q, quadratic effect.

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반추위 내 유기물 대사과정에서 발생하는 gas는 사료의 gross energy 손실을 유발하는 대표적인 예이며, 특히 CH₄ 발생은 반추위에서 탄소 손실과 에너지 손실의 주요 경로이며, 이에 관여하는 methanogens는 수소를 이용해 CH₄를 생성함으로써 발효 중 환원균의 역할을 한다[14,22]. 한편, 박테리오신 생성 L. plantarum을 반추가축에 적용하였을 때, CH₄ 발생량은 감소하고, propionate 비율이 증가하였다는 선행연구들의 결과에서와 같이[13,14,21], 본 연구에서도 LPC 20% 첨가구에서 유사한 결과를 보였다. 이와 같이, 박테리오신 생성 L. plantarum 적용 시, propionate 비율은 증가한 반면 acetate 비율이 감소한 것은 탄소 흐름이 CH₄ 생성과 연관된 acetate 경로에서 수소를 소비하는 propionate 경로로 이동했기 때문인 것으로 사료되며, 이는 반추위 내 CH₄ 발생량 저감과 사료의 gross energy 이용 효율 향상에 기여할 수 있을 것이다. 한편, 반추위 내 CO₂는 주로 발효 중 탈탄산 반응이나 포도당 대사의 산물로 생성되며, 본 연구에서 20%의 CO₂ 발생량이 낮았던 것은 L. plantarum 배양액의 산성 조건에 의해 탈탄산 반응이 억제되었거나, 유기산 축적으로 인해 중간 대사산물의 생성 경로가 제한되었을 것으로 사료된다[12].

반추위 내 LPC 첨가수준을 달리하여 24시간 동안 발효시켰을 때, 영양소 소화율과 발효특성에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 2와 같았다. 반추위 LPC 첨가수준이 반추위 내 pH(quadratic, p = 0.015)와 A:P 비율(linear, p = 0.007)을 제외한 영양소 소화율(IVDMD와 IVOMD)과 반추위 내 발효특성에는 영향을 미치지 않았다(p > 0.05). 반추위 내 pH(quadratic, p = 0.044)와 A:P 비율(linear, p = 0.007)은 LPC 첨가수준이 증가함에 따라 감소하였다. 특히, 반추위 내 pH는 LPC 10% 첨가구가 LPC 20% 첨가구에 비해 높았으며(p < 0.05, 6.47 vs. 6.37), A:P 비율은 대조구가 LPC 20% 첨가구에 비해 높았다(p < 0.05, 2.70 vs. 2.62).

박테리오신과 같은 항균물질, 소화효소 등 다양한 유용물질을 생성하는 것으로 알려진 L. plantarum 균주를 반추위 내 또는 사일리지 제조 시 접종한 선행연구들에서 사일리지 발효품질과 반추위 내 영양소 소화율 개선, 반추위 내 발효특성(ammonia-N과 VFAs) 향상 등의 긍정적인 효과들이 보고되었다[9,12,13,20,21]. 하지만, 본 연구에서는 L. plantarum 배양 부산물인 LPC를 반추위에 첨가하여 24시간 발효시켰을 때, pH와 A:P 비율을 제외한 모든 분석값에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 균주를 직접 적용한 것이 아니라 발효 배양물을 적용한 차이에서 기인하는 것으로 보인다. 또한, 선행연구들은 일반적인 축우용 사료에 균주를 적용한 반면, 본 연구에서는 상대적으로 반추위 내 분해가 쉽고 빠른 정제 전분과 셀룰로오스를 기질로 사용하였기 때문에 상이한 결과를 보이는 것으로 사료된다[23]. 반면, 본 연구에서 LPC 첨가수준이 증가함에 따라 반추위 내 pH가 quadratic 하게 감소하는 결과를 보인 것은 비록 유의적인 차이는 없었으나, in vitro 반추위 내 발효 시 pH에 직접적으로 영향을 미치는 ammonia-N과 total VFA 함량의 quadratic한 변화에 기인한 것으로 보인다. 또한 A:P 비율이 linear하게 감소한 결과도 유의적인 차이는 없었으나, 반추위 내 acetate 함량 감소와 propionate 함량 증가에 기인한 것으로 보인다.

반추위 내 LPC 첨가수준을 달리하여 24시간 동안 발효시켰을 때, total gas, CH₄ 및 CO₂ 발생량에 미치는 영향을 조사한 결과는 Fig. 2와 같았다. 반추위 내 LPC 첨가수준이 증가할수록 건물 기준 total gas 발생량(mL/g DM)은 감소하였으나(quadratic, p = 0.007), 건물 소화율(mL/g DMD)과 유기물 소화율(mL/g OMD) 기준으로는 증가하였다(linear, p < 0.05). 하지만, 건물(mL/g DM), 건물 소화율(mL/g DMD) 및 유기물 소화율(mL/g OMD) 기준 CH₄와 CO₂ 발생량은 LPC 첨가수준이 증가할수록 증가하였다(linear, p < 0.01). 특히, total gas 발생량(mL/g DM)은 LPC 10% 첨가구가 대조구와 LPC 20% 첨가구에 비해 낮은(p < 0.05) 반면, CH₄와 CO₂ 발생량은 LPC를 첨가한 모든 처리구가 대조구에 비해 높았다(p < 0.05).

Fig. 2. Effects of LPC supplement levels on total gas, CH₄, and CO₂ emissions incubated with rumen buffer for 24 h. ^a~cMeans among the treatment with different superscripts differ significantly (p < 0.05). DM, dry matter; DMD, dry matter digestibility; OMD, organic matter digestibility; LPC, Lactiplantibacillus plantarum LM1001 culture; L, linear effect; Q, quadratic effect.

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LPC 첨가수준에 따른 반추위 내 온실가스 발생량은 발효 12시간과는 상이한 결과를 보였다. 특히, LPC 첨가수준이 증가함에 따라, CH₄와 CO₂ 발생량이 발효 12시간에는 감소한 반면, 24시간 이후에는 증가하는 경향을 보였으며, 이는 발효시간이 경과함에 따라 반추위 내 미생물 군집과 이들의 대사경로가 변화하였음을 시사한다[23]. L. plantarum을 적용한 선행연구에서 반추위 내 발효 초기에는 methanogens의 성장을 억제할 수 있었지만, 발효시간이 경과함에 따라 반추위 내 미생물 군집과 수소 이용 경로를 변화시켜 CH₄ 발생량을 증가시킬 수 있다고 하였다[24]. 또한, L. paraplantarum을 옥수수 사일리지에 첨가하였을 때, 발효초기에는 propionate 등의 유기산 함량을 증가시켰으나, 발효가 진행될수록 CH₄ 발생량이 증가하였다고 보고하였는데[25], 이러한 연구결과들은 본 연구에서도 확인할 수 있었다. 한편, CH₄ 생성은 반추위 내에서 수소의 주요 소비 경로 중 하나이며, 경쟁적으로 작용하는 propionate 경로가 활성화되지 않을 경우 methanogens이 수소를 독점할 수 있다[23]. L. plantarum을 첨가 시 초기 CH₄ 생성이 억제되었지만, 24시간 이후에는 유기산 축적 및 환원반응 촉진으로 CH₄ 합성량이 다시 증가할 수 있다[20]. 본 연구에서 A:P 비율이 감소하였으나, CH₄와 CO₂ 발생량이 동시에 증가한 것은 수소 이용경로가 CH₄ 생성 경로로 다시 전환되었을 가능성을 시사한다.